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书接上文组学知识速递（五）|ChIP-seq知多少？，当我们实验完成，拿到下机数据之后，我们最关心的就是，这个数据能不能用？所谓数据能不能用，其实我们会重点关注以下问题：

1）fastq的测序质量过不过关？

2）实验本身有没有问题，处理组与对照组是否有区别？

3）分析结果是否能挖掘出有用或者新的信息？

接下来，一起来找寻答案吧！

Q1  ChIP-seq的分析一般有哪些步骤呢？

ChIP-Seq即染色质免疫共沉淀-高通量测序，是指通过染色质免

1）FastQC用于简单的质量控制（quality control），FastQ_Screen用于检查测序数据有无污染；

2）经过质控的reads通过bowtie2与参考基因组比对；

3）ChIP-seq peaks则用MACS2进行分析；

4）这些peaks则通过ChIPseeker进行注释，motif预测则使用HOMER；

5）最后Peak差异则使用MAnrom1。

Q2  有效数据量达到多少比较合适？

一般情况下，分析得到差异显著的峰的个数随着reads数目的增加而以稳定的比例增加（图中实线所示），这种情况下reads的数目没有饱和。但是，当对Chip样品和Input DNA样品的峰之间的差异定义一个最小的富集阈值后，分析得到的新峰的比率逐渐减小（图中虚线所示），这时，当分析足够具有显著差异peaks数目的时候，结合位点数目的饱和点出现，可以通过定义几个不同的阈值，分析几个曲线到达平台期的数值来定义饱和的标准（图中桔黄色线所示），所指定的阈值即为最小饱和富集比率（the minimum saturation enrichment ratio，MSER），所得到的最小饱和富集比率可以作为测序深度选择的参数。

当然一般的Human或者mouse的ChIP-seq数据选择20 million的数据就已经足够了。测序量不够，一些比较弱的信号可能就会被噪音给盖住。

Q3  比对率达到多少是合格的？

一般来说，Illumina 测序的样品比例应该超过80%。不过也有例外，像IgG这样的非dna结合蛋白的标记率通常较低(约60%)。当然，这些数字也不是绝对的，不是说80%可以，79%就不成，我们得根据实验设计来做具体判断。

80%以上的数据比对到了基因组上，说明至少样本没有出问题。至于数据能不能用，还得看peak calling步骤结果，或者可以用IGV大致看看有没有信号。

Q4  如何理解覆盖度累积曲线中反映的信号富集程度？

对样本比对结果reads累积情况进行展示。一定长度窗口(bin)上reads数进行计数，然后排序，再依次累加画图。input 在基因组上理论是均匀分布，随着测序深度增加趋近于直线，实验组在排序越高的窗口处reads累积速度越快，说明这些区域富集的越特异。

narrow peak ：富集程度高；broad peak：富集程度低。富集程度低不代表失败， 如broad peak。但是如果是转录因子， 富集程度低则需要谨慎对待。

Q5  什么样的igv可视化图可表征特异性片段富集？

Q6  不同的组蛋白组结合区域有什么区别？

虽然大多数ChIP-seq工具都是针对特定基因组区域的sharp peaks，如转录起始位点（TSS），但一些组蛋白修饰与大基因组结构域相关，从而导致富集区域广泛分布。H3K27me3和H3K36me3富集分布在几百个碱基上，而H3K9me3 peaks通常扩展到几兆碱基。增强子标记H3K27ac和H3K4me1产生sharp peaks，但有时也会构建broad富集区域，称为“超级增强子”。H3K4me3启动子标记还可以覆盖小鼠卵母细胞中的broad结构域。这种peak形状和宽度变化影响最佳计算工具的选择。比如，ROSE用于检测超级增强子位点，Music用于计算要研究样本平均的peaks宽度。

Q7  不同的组蛋白call peak的区别是什么呢？

对于不同组蛋白call peaks要根据在基因组结合的模式来判断是narrow 或者broad peaks，然后再判断用何种方法去把相应的peaks 鉴定出来。在得到peaks list以后要随机在peaks list选取几个peaks拿到UCSC上去check一下，看是否这些peaks足够准确。如不够sensitive则需要根据情况调整参数。

Q8  Call peaks的工具该如何选择？

ChIP-seq技术经过多年的发展，已经开发出了很多call peaks的工具，例如FindPeaks、MACS、PeakSeq、SISSRs等等，而且也都有大量发表的高水平文章引用这些工具，常用的是MACS。然而需要注意的是对ChIP-seq数据进行call peaks分析需要具体问题具体分析，这是由于不同的蛋白以及表观遗传学修饰在基因上分布的pattern是非常不一样的，有H3K4me3那样非常sharp的peaks,也有H3K27me3那样非常broad的peaks。因此针对不同的ChIP-seq应该用不同的工具。一般针对于peaks比较sharp的ChIP-seq 数据用MACS14,而针对peaks比较 broad的ChIP-seq数据,用MACS2 callpeaks broad模式。

Q9  怎么知道结合的位置是broad还是sharp呢？用igv看吗，还是有什么评估的方法？

主要先用IGV或者UCSC genome browser先看一下ChIP-seq的pattern更像哪一种patttern，然后再决定使用哪种工具。

Q10  如何在ChIP-seq结果中寻找目标富集的Motif？

有些蛋白是直接结合DNA，此种情况下，基于peak的motif预测结果，查找是否有自己的目标蛋白；

有些蛋白是与其它蛋白互作，间接结合在DNA上，此种情况下，建议先查下自己的目标蛋白是否有互作蛋白，然后再基于peak的motif预测结果，查找motif list中是否有与自己的目标蛋白互作的蛋白。